印迹杂交的方式简介

2020-09-19 健康养生 260阅读

主要用于分析RNA,包括正向杂交、反向杂交、斑点杂交。
正向Northern杂交是将待测RNA固定在纤维膜上,用特异序列DNA探针与其杂交,再显影观察。
反向Northern杂交是将特异序列DNA固定在纤维膜上,用待测RNA做成探针与其杂交,再显影观察。 主要用于分析DNA,也包括正向杂交、反向杂交、斑点杂交。
正向Southern杂交是将待测DNA固定在纤维膜上,用特异序列DNA探针与其杂交,再显影观察。
反向Southern杂交是将特异序列DNA固定在纤维膜上,用待测DNA做成探针与其杂交,再显影观察。 主要用于分析蛋白质,利用了抗原抗体特异性结合的原理。分为抗原法、夹心法、竞争法。
抗原法是将待测抗原固定在膜上,加特异抗体与其结合、洗膜、显色、观察。
夹心法是将一抗固定在膜上,加待测抗原、洗膜、加特异二抗、洗膜、显色、观察。
竞争法是分对照和试验两组,对照组将特异抗原固定在膜上,实验组将待测抗原固定在膜上,都加入特异抗体,显色、观察。用于比较抗原的特异性。 Northern印迹杂交(Northern blot)。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建,称为Southern印迹技术,RNA印迹技术正好与DNA相对应,故被称为Northern印迹杂交,与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。
Northern印迹杂交由Southerm印杂交法演变而来,其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离后,转移到固相支持物上,进行杂交反应,以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小。该法是研究基因表达常用的方法,可推臬出癌基因的表达程度。 Southern印迹杂交(Southern blot)1975年由英国southern创建。
英文解释:use a DNA or a RNA probe to hybridize with DNA from a genome to detect whether there is/are the homologue DNA.
Southern印迹杂交是由凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段,将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上,经干烤固定,再与相对应结构的已标记的探针进行杂交反应,用放射性自显影或酶反应显色,检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析(RELP)等。 10×MSE缓冲液:0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸(MOPS),pH7.0,50mmol/L醋酸钠,1mmol/L EDTA pH8.0。
5×载样缓冲液:50%甘油,1mmol/L EDTA,0.4%溴酚蓝。
甲醛:用水配成37%浓度(12.3mol/L),应在通风柜中操作,pH高于4.0。
20×SSC;
去离子甲酰胺;
50mmol/L NaOH(含10mmol/L NaCl);
0.1mol/L Tris,pH7.5。 [1]40ml水中加7g琼脂糖,煮沸溶解,冷却到60℃,加7ml10×MSE缓冲液,11.5ml 甲醛,加水定容至70ml,混匀后倒入盛胶槽。
[2]等胶凝固后,去掉梳子和胶布,将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。
[3]使RNA变性(最多20μg),RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml,甲醛3.5ml,去离子甲酰胺10ml。
[4]55℃加热15min,冰浴冷却。
[5]加2ml5×载样缓冲液。
[6]上样、同时加RNA标记物。
[7]60伏电泳过夜。
[8]取出凝胶,水中浸泡2次,每次5min。
[9]室温下将胶浸到50mmol/L NaOH和10mmol/L NaCl中45min,水解高分子RNA,以增强转印。
[10]室温下将胶浸到0.1mmol/L Tris HCl(pH7.5)中45min,使胶中和。
[11]20×SSC洗胶1h。
[12]20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。
[13]取出硝酸纤维素膜,80℃真空烘烤2h。

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