northern印迹杂交的RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法

2020-07-09 教育 137阅读

10×MSE缓冲液:0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸(MOPS),pH7.0,50mmol/L醋酸钠,1mmol/LEDTApH8.0。
5×载样缓冲液:50%甘油,1mmol/LEDTA,0.4%溴酚蓝。
甲醛:用水配成37%浓度(12.3mol/L),应在通风柜中操作,pH高于4.0。
20×SSC;
去离子甲酰胺;
50mmol/LNaOH(含10 mmol/L NaCl);
0.1mol/LTris,pH7.5。 [1]40ml水中加7g琼脂糖,煮沸溶解,冷却到60℃,加7 ml 10×MSE缓冲液,11.5ml甲醛,加水定容至70ml,混匀后倒入盛胶槽。
[2]等胶凝固后,去掉梳子和胶布,将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。
[3]使RNA变性(最多20μg),RNA4.5ml,10×MSE缓冲液20ml,甲醛3.5ml,去离子甲酰胺10ml。
[4]55℃加热15min,冰浴冷却。
[5]加2 ml 5×载样缓冲液。
[6]上样、同时加RNA标记物(同位素(32P)dCTP)。
[7]60伏电泳过夜。
[8]取出凝胶,水中浸泡2次,每次5min。
[9]室温下将胶浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min,水解高分子RNA,以增强转印。
[10]室温下将胶浸到0.1mmol/L TrisHCl(pH7.5)中45min,使胶中和。
[11]20×SSC洗胶1h。
[12]20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。
[13]取出硝酸纤维素膜,80℃真空烘烤2h。
<3>注意事项
[1]严格遵守试验规则,务必准确。
[2]由于好多药品是有毒的,对人体有害,请注意自身安全,做好防护。

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