因为第三步骤酒精脱色时间太短，革兰氏阴性菌脱色不到位，导致在显微镜下革兰氏阴性菌被判断为革兰氏阳性。酒精脱色是非常重要的一步，也是革兰氏染色成功与否的关键。
革兰阳性细菌的肽聚糖层较厚，经乙醇处理后使之发生脱水作用而使孔径缩小，结晶紫与碘的复合物保留在细胞内而不被脱色，成为紫色；
而革兰阴性细菌的肽聚糖层很薄，脂肪含量高，经乙醇处理后部份细胞壁可能被溶解并改变其组织状态，细胞壁孔径大，不能阻止溶剂透入，因而将结晶紫与碘的复合物洗去而被脱色。
扩展资料：
革兰氏阳性细菌：金黄葡萄球菌、链球菌、肠球菌、利斯特菌等
革兰氏阴性杆菌：克雷白杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、流感嗜血杆菌、沙门氏菌等
无论阳性菌还是阴性菌都有杆菌和球菌。葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌是临床最为常见的病原菌，葡萄球菌属于革兰阳性球菌，大肠杆菌属于革兰阴性菌中的肠杆菌科，除大肠杆菌以外，临床较常见的肠杆菌科细菌还有变形杆菌、沙门氏菌、克雷白杆菌；绿脓杆菌属于假单胞菌，为非发酵菌，是临床常见的较耐药革兰阴性杆菌。
参考资料来源：百度百科-革兰阴性菌
