常将放射性同位素如32P连接到某种脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）上做为标记物，然后通过切口平移法标记探针。
切口平移法（nicktranslation）是利用大肠杆菌DNA聚合酶I(E.coliDNApolymeraseI)的多种酶促活性将标记的dNTP掺入到新形成的DNA链中去，形成均匀标记的高比活DNA探针。其操作方法如下：
⑴取1?gDNA溶于少量无菌双蒸水中，加入5?l距离大约10×切口平移缓冲液(0.5mol/LTris－HCl，PH7.2；0.1mol/LMgSO4；1mmol/L二硫苏糖醇；500?g/mL牛血清白蛋白），加入除标记物（如?-32p-dATP）外的其它三种dNTP（如dCTP，dGTP，dTTP）溶液，20mmol/L溶液各1?l。
⑵加入100?ci（10?l）标记物溶液，加入无菌双蒸水至终体积为46.5?l，混匀，加入0.5?l稀释的DNaseI溶液，混匀；加入1?l（约5单位）E.coliDNApolymeraseI，混匀。
⑶置14-16℃反应1-2小时。可将生物素、地高辛连接在dNTP上，然后象放射性标记一样用酶促聚合法掺入到核酸链中制备标记探针。也可让生物素、地高辛等直接与核酸进行化学反应而连接上核酸链。其中，生物素的光化学标记法较为常用。其原理是利用能被可见光激活的生物素衍生物-光敏生物素（photobiotin），光敏生物素与核酸探针混合后，在强的可见光照射下，可与核酸共价相连，形成生物素标记的核酸探针。可适用于单、双链DNA及RNA的标记，探针可在-20℃下保存8-10个月以上。具体操作方法如下：
⑴将双链DNA变性或用NaOH处理形成缺口，单链DNA或RNA毋需处理，将核酸样品溶于水。
⑵暗室下在微量离心管中加入10?gDNA，1mg/ml光敏生物素20?l，加水至50?l，混匀。
⑶冰浴中打开离心管盖，在300-500瓦灯下照射10分钟（液面距灯泡10cm）。
⑷加入100?l0.1mol/LTris－HCl，pH8.0，加入100?l2-丁醇抽提两次，离心，弃上层。
⑸乙醇沉淀核酸探针；用70%乙醇漂洗真空抽干，备用。
除上述标记法外，探针的制备和标记还可通过PCR反应直接完成。
