植物病毒的外壳是一种核蛋白，在蛋白的表面带有抗原决定簇，当植物病毒进入动物体内时，即可产生与抗原相应的抗体，这种带有抗体的血清即为抗血清。相应的抗原抗体之间可产生专化性的结合，即抗体只能与其相应的抗原结合并产生一定的反应，此即血清反应。这种反应在植物体外也能进行，根据这种反应可以测定两种病毒间的关系。因而，血清学检测成为植物病毒的重要鉴定技术。常见的血清反应主要有以下几种：
中和反应：使含有植物病毒的汁液与相应抗血清中的抗体充分结合，当抗体过量时，可将所有植物病毒抗原全部吸收掉，此时因植物病毒汁液中已没有病毒粒子存在而失去侵染性。此即为中和反应，不仅可对植物病毒进行定性，还可用于定量测定。
沉淀反应：将一系列稀释度的抗原（病毒）和一系列稀释的抗体（抗血清）分别混合，在两者稀释比例适宜范围内可出现沉淀物，此即为沉淀反应。此类反应如：微量沉淀反应，琼脂双扩散反应，及免疫电泳等，都是在植物病毒检验中最常见的血清学技术。
凝集反应：把病毒的抗体先吸于一种与免疫无关的颗粒表面，然后使其与相应的抗原结合而出现的凝集，即为凝集反应。常用于吸附抗体的颗粒有皂土、乳胶、炭末、血细胞、A蛋白等。
抗体标记：对抗体用荧光素、酶或同位素等进行标记，然后通过对标记物的检测追踪抗原，常用的有酶联免疫吸附、荧光免疫、同位素免疫实验等，这类检测技术灵敏度极高，适于对微量抗原的检测。
现将在植物检疫中常用的几种血清学技术介绍于下。
1.微量沉淀反应
在溶有抗原的溶液内按适当比例加入抗血清时，抗原与抗体互相结合而沉淀。其方法如下：
（1）用蜡笔在培养皿底部各划8条横竖线形成方格。
（2）取两排小试验管，每排7～8个，一排用于抗原，一排用于抗血清，每试管中加0.2ml的缓冲液。
（3）制备1mg/ml纯化病毒原液，在抗原稀释排中加0.2ml原液于第一试管，用1ml的移液管再从中吸0.2ml移至第二管，然后再移0.2ml于第三管，一直移到最后一管，各管的稀释度分别为原液的1/2至1/128。
（4）在小试管中加1.5ml含0.025%防腐剂NaN3的缓冲液，在缓冲液内混入0.1ml未稀释的抗血清，制备出1/16稀释度的抗血清作为原液；在第二排的第一试管中加0.2ml的原液，混合后移0.2ml至第二管，如此一直到最后一管，制备出1/32～1/2048的稀释系列的抗血清。
（5）用微量移液管从抗血清最高稀释度（1/2048）开始，在培养皿的第七横排的每个方格滴加1滴，同样将1/1024稀释度的抗血清加到第六横排，这样将板上所有的方格均滴加各种稀释度的抗血清。
（6）用另一移液管从最稀的抗原液开始，在第七纵排每方格内滴加1滴，按同样方法在第一至第七纵排各方格内滴加各种稀释度的抗原。在所有第八横排和纵排的方格内滴一滴缓冲液做对照。随后在反应液滴上复盖一层液体石蜡油防止蒸发。
（7）将制备好的培养皿在室温湿润环境下孵育2h后，在暗室用双目解剖镜观察，然后在普通冰箱内过夜，第二天继续观察结果，此时沉淀已清晰可见。
以最浓的沉淀为四，以下逐渐减弱的梯度分别记为三、二、一，以三为抗原最大稀释度和产生沉淀的最小血清用量，作为抗原抗体最适比例
微量沉淀技术测定抗原抗体最适反应浓度表
（8）实际测定时，用最适稀释度的抗血清与其相应的抗原和异种抗原进行反应，或用最适稀释度的抗原与其相应的抗血清和异种抗血清进行反应，均可观察它们间的血清学关系。如表0-4-2所示，
微量沉淀技术测定多种抗原间血清学关系表
各供试抗原的稀释度为1.56mg/ml，与1/4至1/1024的不同稀释度的抗血清反应结果表明，第一、二、五、六、七横排的抗原与抗血清的相应抗原是相同的，第三、四两排抗原与抗血清的相应抗原虽然不同，但有一定亲缘关系，第八、十排抗原则与抗血清的相应抗原有远缘关系或无血清学关系，第九排的抗原则完全无关。
2.琼脂双扩散试验
琼脂凝胶的含水量极高，允许分子质量20万u以下的大分子物质自由通过，绝大多数的抗原和抗体分子质量都在20万u以下，在琼脂凝胶中的运动所受阻力甚小，可自由扩散，免疫双扩散就是应用这一原理，在一块琼脂凝胶板上打几个小孔，分别置入抗原及其相应抗体，抗原与抗体分别向凝胶中扩散，形成浓度梯度，在抗原抗体浓度最适比例处，形成肉眼可见的抗原抗体结合物的沉淀带，带的大小形状数量和密度决定于所测试的抗原抗体的特性。本法适于检测植物粗汁液、澄清液和高度纯化的抗原。试验时需设置健康植物汁液及标准抗原作为阴性和阳性对照。本法的特点是可同时检测一种抗原对多种抗体，或一种抗体对多种抗原间的血清学关系，对病毒的鉴别极为方便。缺点是灵敏度较低，抗血清用量大，检测时间长。具体检测技术如下：
（1）称取琼脂加入适当的缓冲液中，用水浴或微波炉加热至琼脂溶解，按0.1%加叠氮化钠。置培养皿或玻璃平板于水平台面，当琼脂冷却至60℃时，倒适当量于板上厚2mm（50mm*9mm的板需9ml，100mm*13mm的板需26ml）。静置至凝固。
（2）将模式图置于板下，用打孔器打孔，挑除孔中琼脂，孔的排列有多种形式，常用的排列，由一个中央孔和周围六个孔组成，孔的直径7mm，周围孔与中央孔的距离为3～4mm。
（3）用缓冲液或生理食盐水在小试管中稀释抗原，在周围孔中加最适稀释度的抗原，在中央孔中加最适稀释度的抗血清。外围孔中加倍比稀释系列的抗原，中央孔加倍比稀释系列的抗血清，产生致密狭窄的沉淀线的组合为最适浓度。
（4）将培养皿在保湿环境下进行孵育，次日在暗背景下观察沉淀线出现情况。在印有排列模式团的纸上，图记沉淀线的形式，沉淀线图形可用照相或染色保留。
（5）结果的判断：根据沉淀线的形状分析抗原与抗体，及抗原互相间的关系。
对长形病毒进行琼脂双扩散检测时，可在琼凝胶介质中加入十二烷基磺酸钠（SDS），此剂为一种阳离子表面活性剂，可将病毒裂解成具有抗原活性的可扩散的片断利于检测。
3.对流免疫电泳
在以琼脂凝胶为介质的情况下，免疫球蛋白带有微弱负电荷不能抵消电渗作用，故在电泳时向负极迁移，而一般抗原蛋白带有较强的负电荷，抵消电渗后仍向正极迁移。依此设计的对流免疫电泳是将琼脂电泳与免疫沉淀相结合的方法，将抗原病毒放在琼脂凝胶靠近阴极一侧，抗体放在靠近阳极一侧，在直流电场中，抗原迁向正极，免疫球蛋白迁向负极，相遇后形成免疫沉淀线。具体技术如下：
（1）凝胶床的制备。取定量琼脂粉用蒸馏水浸泡2～3d，每日换水1～2次，用硼酸缓冲液配成1%～1.2%的琼脂液，加0.1%叠氮化钠。将玻璃放在水平台上用吸管将缓冲液琼脂注到板面，制成2mm厚的凝胶床并打孔。
（2）将制好的凝胶床放在电泳槽内，加缓冲液（用配制琼脂凝胶的缓冲液稀释1倍）离床面2～4cm，在琼脂板阴极一端孔中加入抗原，在靠阳极一端孔中加入特异性抗血清，在琼脂床的两端用两层纱布使琼脂板与电泳槽中的缓冲液相连，进行电泳。
（3）进行电泳时，电压、电流和时间，根据缓冲液离子强度、电泳床大小和抗原性质而有所不同。只要不使病毒抗原变性，尽量保持较高的电压，如电流超过2mA，电泳应在低温下进行。
（4）电泳完毕后，将电泳板放在黑色背景处观察，也可将电泳完毕的琼脂凝胶板先浸在生理食盐水中30min，然后放在苦味酸溶液中20min，可将背景染成黄色，沉淀为白色，便于观察。
免疫电泳与琼脂双扩散相比有三个优点，快速、灵敏并可用于在琼脂中扩散慢的长形病毒。
4.乳胶凝集试验及A蛋白乳胶凝集试验
用特异性抗血清提纯的免疫球蛋白，将其吸附在乳胶粒子上，制备抗体免疫球蛋白致敏乳胶。当与相应的抗原相遇时即可产生凝集反应。这是一种灵敏度高特异性强的血清学技术，但是每次都要特异性抗血清提取抗体γ球蛋白，制备手续繁杂不便应用，如直接用抗血清致敏乳胶则显著影响效果。其后Querfurth（1979）发现A蛋白可吸附免疫球蛋白且不影响与相应抗原结合。这样就可先使A蛋白与乳胶粒子结合，再与抗血清中的免疫球蛋白结合，形成A蛋白-乳胶-免疫球蛋白的复合体。这种乳胶凝集试验可简化致敏免疫球蛋白的过程，而获得同样效果。具体做法如下。
（1）免疫球蛋白致敏乳胶的制备。
将特异抗血清用33%饱和硫酸盐析法提取球蛋白，悬浮于0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl（含0.02%PVP）缓冲液内，取10%空白乳胶稀释15倍后与等量适宜浓度的球蛋白液混合，置室温2h后移入冰箱内过夜。经低速离心（7000r/min，20min）取沉淀悬浮于缓冲液内，经反复离心洗涤2次后将最后沉淀物悬浮于缓冲液内即可得抗体球蛋白的致敏乳胶。
（2）A蛋白乳胶致敏抗体的制备。
将市售A蛋白溶于0.1mol/L、pH8.2的甘氨酸缓冲液内，制成A蛋白溶液，与等量稀释15倍的空白乳胶液混合，置室温3h，移入冰箱过夜。低速离心（7000r/min20min）后将沉淀悬浮于甘氨酸缓冲液，反复离心洗涤2次，沉淀悬浮于甘氨酸缓冲液制备A蛋白乳胶溶液，与等量适宜稀释度的抗血清混合，置室温下3h后移入冰箱过夜。再反复离心洗涤2次，最后将沉淀悬浮于与抗血清等等量的甘氨酸缓冲液内，即可得A蛋白乳胶致敏抗体。
（3）检测法。
用0.05mol/L、pH7.2的Tris-HCl缓冲液（含0.02%PVP，0.02%NaN3）按等倍比稀释抗原，制成20、40、80、160、320、640、1280的系列浓度，在一洁净玻璃板上，用笔画好方格，每格加2滴不同稀释度的抗原，然后再加1滴乳胶致敏抗体（或A蛋白乳胶致敏抗体）用微量血液振荡器以120r/min振荡混合后，用肉眼或10～25倍解剖镜观察结果。同时设空白乳胶液和健汁液对照。
阳性反应表现有明显的絮状或颗粒状凝集物，背景清明透亮，阴性反应则仍为均匀的牛乳状液。也可用浊度计检测其凝集度。
此法受健康植株蛋白的干扰较小，适于直接采自病株的澄清液，不但适合球状病毒，对杆菌状病毒，棒状病毒，线状病毒也适用，并有较高的灵敏度。但对效价低的抗血清或含有乳状胶体的植物不适用。
5.酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验是一种固相吸附和免疫酶技术相结合的方法，将抗原或抗体包被在固相支持物上，使免疫反应在固体表面进行，并借助标记在抗体上的酶与底物所产生的颜色，检测相应的抗原。此法灵敏度高，特异性强，快速简便极适宜植物检疫应用。常用的检测方法有以下几种：
（1）直接法。
将待测样品抗原（病毒）加入聚乙烯多孔板内，保温后洗涤，使附着于壁上的抗原与加入的酶标抗体γ球蛋白反应，洗涤后保留与抗原结合的酶标γ球蛋白，加入酶的底物，用分光光度计进行检测。
（2）间接法。
先用抗兔球蛋白山羊抗体与酶结合制备酶标记抗体，将待检抗原包被于固相载体，经过孵育洗涤，加入特异性兔抗血清，孵育洗涤后加羊抗兔酶标记抗体，孵育洗涤后加入底物，观察结果。
（3）双抗体夹心法。
先将特异抗体免疫球蛋白包被于固相载体，保温洗涤后，加待测抗原，使与吸附于载体上的抗体反应，保温洗涤后再加入特异抗体的酶标记物，最后加底物观察反应结果。
（4）A蛋白酶联法。
将A蛋白用pH9.6的甘氨酸缓冲液稀释后包被微板，加入特异性抗血清，使其与已固定在微板上的A蛋白结合，再加入待测抗原使其与特异性抗体反应，再加入特异性抗体，使其与抗原反应，再加酶标记A蛋白，最后加酶的底物测其光密度值。
（5）异种动物双抗体夹心法。
先将第一抗体（兔血清抗体）包被微量反应板，加待测抗原后，加适宜浓度的第二抗体（鼠腹水抗体），再加入市售羊抗鼠酶标记物，最后加底物观察反应，一般8h即可得出结果。此法保持了双抗体夹心法快速准确灵敏度高的特点，对球状病毒、杆状病毒、线状病毒、棒状病毒均可应用。抗体不必纯化可直接使用（但未纯化的抗血清需先选择其最适工作浓度），使用市售酶标记物，可省去制备酶标记抗体的复杂手续，还可克服间接法非特异性反应干扰大的弱点。
（6）生物素抗生物素酶联法。
生物素具有很强的亲和力，是抗原抗体反应的1万倍，两者一旦结合就难以离解，且不受酸碱变性剂蛋白溶解酶及有机溶剂的影响，具有高度稳定性，生物素一经活化可与蛋白质呈偶联结合，即一个大分子可结合多个生物素分子，生物素又可大量结合在酶标记物上，使酶标记物成为多价，而抗生物素本身又是一个多价分子，每一亚基均可结合一个生物素分子，因此，这种方法可产生多级放大，使灵敏度提高10倍以上，并降低非特异性反应，把酶联免疫吸附技术又提高一步。具体方法如下：
先将第一特异抗体（兔抗体或鼠腹水抗体）包被在固相载体，加待检抗原，加第二特异性抗体（鼠腹水抗体或兔抗体），再加入相应生物素化（羊抗鼠或羊抗兔）免疫球蛋白，再加抗生物素酶结合物，最后加入底物观察O.D.值。
（7）膜上斑点酶联法。
先用软铅笔在一张适宜大小的硝酸纤维素膜上划好边长1cm的方格网，把纤维素膜浸入TBS缓冲液漂洗30min，然后将膜放在两张滤纸之间，在室温下风干，用移液器将抗原抽提液滴在各方格中央，室温下风干，用TBS-T缓冲液（含0.5%Tween的TBS液）洗膜5min，取出后放在滤纸上至膜表面水滴消失，然后浸入封闭液（含1%牛血清蛋白，和2%聚乙烯吡咯烷酮的TBS-T液），在37℃下保温1h，取出晾干后，浸在用封闭液稀释的第一抗体溶液，在37℃下保温1h，用TBS-T液洗膜10次，每5min换液一次。将膜浸入稀释度1/200的酶联球蛋白，室温保温1h，用上法洗膜后，用碱性磷酸酯酶缓冲液冲洗两次，每次10min，将膜浸入酶底物溶液内，室温下避光5～15min，显色完全后弃去底物液，用终止液（10mmol/LTris-HCl，pH7.5，5mmol/LEDTA）洗膜30min，置膜于滤纸内彻底风干后观察结果。
此法可克服塑料板的不足，只用目测就可对结果定性，不需要复杂的仪器，所需抗原抗体量均很少，灵敏度比常规酶联法高10倍以上，适合大量抗原的检测。
6.免疫电镜
电镜检测可快速确定病毒粒子的形状，是鉴定病毒不可缺少的技术，但有的样品浓度很低，用普通的电镜技术不易观察，如将病毒粒子包被后，抗体可把病毒粒子捕捉成聚集物便于观察。同时还可从病毒粒子与抗体的结合情况，观察两者间的血清学关系。通常使用的有以下几种方法：
（1）叶片浸沾血清技术。
把一滴稀释的抗血清，滴在有膜的铜网上，将叶片的新鲜切口浸入血清滴中1～2s，置于室温下5～10min，使血清与相应的病毒聚集并装饰起来，再进行负染检镜。
（2）Derrick氏法。
把火棉胶膜铜网在24℃下，置于按1∶10比例稀释于Tris缓冲液的抗血清内，然后将铜网用缓冲液冲洗后使用。把病毒的粗提液稀释于含HCl的Tris缓冲液内，将已用血清包被的铜网浮于0.1ml的病毒稀释液内1h（24℃），先用Tris-HCl液再用水冲洗，然后干燥喷镀。
（3）聚集法。
把抗血清用磷酸缓冲液稀释到1/100的浓度，取10μl滴于载玻片，将切成2mm见方的病叶在血清滴中压碎，在湿室中保湿15min，用镊子持有膜铜网蘸取液滴，用20倍磷酸缓冲液冲洗后，再用蒸馏水洗，最后用5滴醋酸氧铀染色观察。
（4）修饰法。
取2mm见方的病叶在载玻片上的10μl蒸馏水中压碎，持有膜铜网沾此液滴，将病毒粒子吸附于铜网上，然后将铜网用20滴的磷酸缓冲液冲洗，吸去水分后加1滴稀释成1/100的抗血清，在湿室中保湿15min后，将铜网用20滴磷酸缓冲液和30滴蒸馏水冲洗，最后用醋酸氧铀染色检镜。
（5）诱捕修饰法。
先将铜网用稀释1/10或1/100的特异性抗血清包被，再把病毒样品滴于铜网，保湿15min，用缓冲液及蒸馏水冲洗吸干，再加1滴稀释成1/100的特异性抗血清，孵育15min后，用缓冲液和蒸馏水冲洗，吸干染色检镜。
（6）羊抗兔血清诱捕修饰法。
在诱捕修饰法未染色以前，再加1滴稀释1/20的羊抗兔血清，孵育15min，洗涤后染色镜检。此法因病毒粒子外壳包被有两层血清，明显加粗，在2000倍的低倍电镜下即可清晰地看到病毒粒子。
（7）A蛋白诱捕修饰法。
在福尔马膜的铜网上滴1滴50mg/ml的A蛋白液，孵育后洗去多余的A蛋白，再包被稀释100倍的特异性抗血清，滴加抗原，再滴加特异性抗血清，最后染色镜检。此法比一般诱捕修饰法灵敏度高，能捕捉更多病毒粒子。
