细菌耐药问题日趋严重,对人类健康造成极大威胁,成为全球关注的热点.细菌耐药性的产生与目前抗菌药的滥用有着重要关联.近年,耐药细菌越来越多,耐药范围越来越广,程度越来越高,多重耐药菌不断出现.在抗菌药应用的早期,几乎所有细菌感染性疾病都很容易治愈.随着抗菌药的大量和长期使用,出现了越来越多的多重耐药细菌.在畜牧养殖业中,为防止疾病感染及促进动物生长,大量的抗菌药被应用于饲料中,由于剂量不足及残留造成了耐药菌株的出现及耐药性的传播,并且耐药性可通过食物链转移到人群,从而极大地危害了人类自身的安全.因此,了解细菌的耐药机理、积极预防细菌耐药性的产生及加剧,寻找、开发新的抗细菌耐药或防细菌耐药的药物迫在眉睫.
1 抗菌药的主要作用机理
Bauman R W主编的《微生物学》[1]中,抗菌药的作用机理主要有以下5种.
1.1 抑制细胞壁的合成
这些药物主要选择性作用于某些有细胞壁的真菌、细菌,而对宿主本身没有毒性作用.这些药物包括青霉素（Penicillins）、头孢菌素（Cephalosporins）、万古霉素（Vancomycin）、杆菌肽（Bacitracin）、异烟肼（Isoniazid）、乙胺丁醇（Ethambutol）等.它们主要通过抑制细胞壁的主要成分——肽聚糖的合成,从而引起细胞壁的通透性改变,大量水分进入细胞浆中而引起细胞的裂解.
1.2 抑制蛋白质的转录或合成
由于真核生物和原核生物核糖体的差异,真核生物的核糖体主要是80 S,由60 S和40 S两个亚基组成,而原核生物的核糖体是70 S,主要由30 S和50 S两个亚基组成.属于这一种作用机制的主要抗菌药包括氨基糖苷类（Aminoglycosides）,如链霉素(Streptomycin)、阿米卡星（Amikacin）、托普霉素（Tobramycin）、庆大霉素（Gentamicin）等,它们主要作用于核糖体的30 S亚基,改变它的形状,导致mRNA不能被正常地翻译而引起蛋白质合成受阻；而四环素类（Tetracyclines）也是作用于核糖体的30 S亚基,但它们主要与A位特异性结合,即tRNA的结合位点,从而阻止了肽链的延伸.另外一些抗菌药,如氯霉素（Chloramphenicol）主要阻断50 S亚基的酶结合位点而抑制蛋白质的翻译过程；林可霉素（Clindamycin）和大环内酯类（Macrolides）则主要是结合到50 S亚基的不同部位,抑制核糖体从一个密码子到另一个密码子的延伸过程,从而使蛋白质的翻译过程停止,蛋白质的合成受到抑制.
1.3 破坏胞浆膜的完整性
这类抗菌药主要是一些抗真菌的药物,如两性霉素B（Amphotericin B）,它们主要能够与细菌细胞胞浆膜上的一些磷脂成分结合,破坏胞浆膜的完整性,从而导致细胞的裂解.
1.4 影响细菌的代谢途径
这类抗菌药的代表就是磺胺类（Sulfonamides）,作为对氨基苯甲酸（paraaminobenzoic acid, PABA）的类似物,它们可以竞争性结合对氨基苯甲酸酶,对氨基苯甲酸酶催化PABA转化为二氢叶酸,二氢叶酸在体内进一步代谢成为四氢叶酸（tetrahydrofolic acid, THFA）.THFA是合成嘌呤和嘧啶核苷酸的重要辅酶,磺胺类的这一种竞争性的抑制作用,直接导致细菌体内THFA的严重缺乏,从而导致细菌细胞内的代谢混乱而引起细菌的死亡.
1.5 抑制核酸的合成
这类药物主要包括一些核苷酸的类似物,它们可以插入到DNA或RNA链中,导致DNA或RNA复制过程中的错配,而干扰其正常的功能.另外一些药物,如喹诺酮（Quinolones）、氟喹诺酮（Fluoroquinolones）可以特异性地抑制DNA旋转酶的活性,抑制细菌DNA复制时的解螺旋,导致DNA复制的受阻.
2 细菌耐药性产生的生化机理
细菌的耐药性机理主要有生化机理和基因机理两个方面.目前研究的比较清楚的生化机理主要有以下几个方面.
2.1 细菌产生破坏药物结构的酶
这一类的耐药细菌常常可以产生一种或多种水解酶或钝化酶来水解或修饰进入细菌细胞内的药物,使之失去生物活性.这是引起细菌耐药性的最重要的机制,目前发现和分离的钝化酶主要有以下4种.
（1）β-内酰胺酶(β-Lactamase).它是细菌对β-内酰胺类抗菌药耐药的主要原因,由于β-内酰胺酶的产生,使其β-内酰胺环的酰胺键断裂而失去抗菌活性.该类酶可以为染色体介导,也可为质粒介导.Bush K[2]根据底物及酶抑制剂的作用类型将剂的作用类型将β-内酰胺酶分为4种,即A组β-内酰胺酶(主要水解青霉素类),B组金属酶(其活性部分是结合锌离子的硫醇),C组β-内酰胺酶(主要水解头孢菌素类),D-组β-内酰胺酶(苯唑西林水解酶).
（2）氨基糖苷类钝化酶.细菌对氨基糖苷类 (Aminoglycosides)抗生素产生耐药性的最重要的原因就是产生了对这一类药物的共价修饰酶.这些酶通过磷酸化、乙酰化和腺苷酸化等途径对其进行修饰而使其灭活.目前,这一类的共价修饰酶主要有[3]磷酸转移酶（O-phosphotransferases, APHs）, 腺苷酸转移酶（O-adenyltransferases,ANTs）和N-乙酰转移酶（N-acetyltransferases,AACs）3类.现在已经对这些酶的晶体结构有了清楚的研究.
（3）氯霉素乙酰转移酶.此酶为一种胞内酶,早在1987年,Lyon等就确定此酶由质粒或染色体或转座子基因编码,主要作用是使氯霉素类抗生素转化为无抗菌活性的代谢物[4].
（4）红霉素酯化酶.此酶是一种体质酶,由质粒介导,主要作用是水解红霉素及大环内酯类抗生素结构中的内酯而使之失去抗菌活性[4].
2.2 靶位的改变
由于抗菌药作用的靶位(如核糖体和核蛋白)发生突变或被细菌产生的某种酶修饰而使抗菌药物无法发挥作用,以及抗菌药的作用靶位(如青霉素结合蛋白和DNA回旋酶)结构发生改变而使之与抗生素的亲和力下降,这种耐药机制在细菌耐药中普遍存在.目前的研究表明,β-内酰胺类抗菌药物的作用靶位为青霉素结合蛋白(PBP),氨基糖苷类和四环素抗菌药物的作用靶位为核糖体的50 S亚基,大环内酯类和氯霉素以及克林霉素的作用靶位为核糖体的30 S亚基,利福霉素类的作用靶位为依赖于DNA的RNA聚合酶,哇诺酮类的作用靶位为DNA促旋酶,磺胺类的作用靶位为二氢碟酸合成酶和二氢叶酸还原酶,万古霉素的作用靶位为细胞壁五肽末端的D-丙氨酰-D-丙氨酸末端的游离羧基[5].这些作用靶位结构的细微变化都有可能产生很高的耐药性.
2.3 渗透屏障
由于细菌细胞壁的障碍或细胞膜通透性的改变,形成一道有效屏障,抗菌药无法进入细胞内达到作用靶位而发挥抗菌效能,这也是细菌在进化与繁殖过程中形成的一种防卫机制.这类耐药机制是非特异性的,主要见于革兰氏阴性菌.因为革兰氏阴性菌细胞壁黏肽层外面存在着类脂双层组成的外膜,外层为脂多糖,由紧密排列的碳氮分子组成,阻碍了疏水性抗菌药进入菌体内.外膜上存在着多种孔蛋白,分子较大者为OmpF,分子较小者为OmpC,它们可形成特异性通道(OprD)和非特异性的通道(OprF),作为营养物质和亲水性抗菌药物的通道[6].抗菌药物分子越大,所带负电荷越多,疏水性越强,则不易通过细菌外膜.细菌发生突变失去某种特异孔蛋白后即可导致细菌耐药性,另外由于外膜蛋白OprF的缺失,使药物不易通过而产生耐药性.如绿脓杆菌对多种抗菌药的耐药性[4].
而在革兰氏阳性菌中细胞膜被一层厚厚的肽聚糖细胞壁所包裹.尽管细胞壁具有很强的机械强度,但由于其结构比较粗糙,几乎不影响抗菌药物这样的小分子物质扩散至细胞内[4].
2.4 药物主动外排系统
药物的主动外排系统被认为是导致广泛的细菌对多种抗生素产生耐药性的重要原因.目前研究表明主要有两大类外排系统：特异性（单一性）外排系统和多种药物耐药性（multidrug resistance,MDR）外排系统.一般来说,两个外排系统的作用都各不相同[7-8],其中特异性外排系统一般只作用于单一的底物（药物）,常常是某一类的抗生素,如四环素、氯霉素、链霉素等.而多种药物耐药性外排系统可以作用于多种抗菌药或者一些结构和功能不相关的复合物.它们被认为是由保护细菌细胞免受在生理代谢过程中所产生毒素损坏的内在外排系统进化而来的[9].Mcmurray L M等[10]最早报道了在大肠杆菌中发现四环素的主动外排系统.从那以后,越来越多的主动外排系统在不同的细菌中被发现,而且编码这些系统的基因可以通过它们所处的不同位置（染色质或质粒）而垂直或水平传递给其他同种或异种细菌,从而使耐药性的情况更为严重.目前研究的比较清楚的有以下几个主动外排系统.
（1）介导大环内酯类、林可酰胺等耐药性的主动外排系统.大环内酯类、林可胺类和链霉素等抗菌药的耐药性主要由主要转运器（major facilitator）和ABC 转运器（ABC transporter）两个蛋白家族介导的主动外排系统引起.其中,MF类蛋白家族通常由12个～14个跨膜片断组成,不含有核苷酸结合区.它们主要作为反通道,从膜上的H＋梯度中获取能量.而ABC类蛋白家族则不同,它们含有两个核苷酸结合区,可以结合ATP来获取能量[9].MF类蛋白家族主要有两个基因编码,分别是mef(A)基因[11]和mef(E)基因[12],其中mef(A)基因主要编码跨膜蛋白,它们的作用底物仅仅局限于大环内酯类抗生素[13].mef(A)基因最早被发现存在于化脓链球菌中,后来在Lancefield的C群和G群链球菌中也被确定存在.而mef(E)基因就主要存在于肺炎链球菌中[12].Luna V A等[14]研究表明mef(A)基因广泛存在于革兰氏阳性菌中,如链球菌、肠球菌、微球菌等.接合实验表明这几类细菌的mef(A)基因可以成功转移给粪渣肠球菌（Enterococcus faecalis）.
ABC类蛋白家族在革兰氏阳性菌和一些土壤的细菌中广泛存在,它包括许多个不同的亚群,比较重要的主要有以下3个亚群：Msr(A)蛋白亚群、Vga(A)和Vga(B)蛋白亚群,还有最近从粪渣肠球菌中分离到的Lsa蛋白亚群.其中Msr(A)蛋白亚群中主要包括Msr(A)蛋白以及和它结构类似的Msr(SA)、Msr(SA)’和Msr(B),由于它们的氨基酸序列相似性高达98％,现在都使用Msr(A)蛋白来指代这一群蛋白[15].它们主要介导对大环内酯类抗生素和B类链霉素的耐药性；Vga(A)和Vga(B)蛋白是葡萄球菌的蛋白,编码这两个蛋白的基因Vga(A)和Vga(B)被确定存在于pIP524 or pIP1714等质粒上[16].它们主要介导对链霉素的耐药性；而Lsa蛋白主要介导对林可霉素的耐药性.
（2）介导四环素耐药性的主动外排系统.细菌对四环素产生的耐药性主要由膜相关的Tet蛋白介导,它主要通过和四环素的阳离子复合物交换质子而发挥作用的.所有的Tet蛋白都属于MF蛋白家族,目前已经发现了至少18种四环素主动外排系统蛋白,根据它们氨基酸的差异,可以将它们分为6个亚群[17].第1个亚群包括A～E、G、H、I、J和Z等Tet蛋白,tet(A), tet (B), tet(C), tet(D)和tet(E)基因广泛存在于肠道菌、假单胞菌、气单胞菌和弧菌中,而tet(H)基因是巴氏杆菌属的主要Tet基因；第2个亚群主要包括Tet(K) and Tet(L)蛋白,它们主要存在于葡萄球菌、杆菌、链球菌和其他革兰氏阳性菌中；第3个亚群主要包括Otr(B)和Tcr3蛋白,它们从葡萄球菌中被分离出来,由14个跨膜片断组成,可能是作为防止四环素及其代谢产物发挥作用的一种自我防御系统；第4个亚群是来源于梭菌属的TetA(P)蛋白；第5个亚群是来源于分支杆菌属的Tet(V)蛋白；最后一个亚群是没有定名的Tet蛋白.
