（1）脱毒蒜种微繁的环境要求
在离体培养条件下，大蒜任何组织培养成脱毒试管苗、试管鳞茎，都需要适宜的基质、营养、温度、湿度、光照等条件；同时，需要外源补给适宜、适度的激素，以诱导和促进愈伤、生根、发芽、生长发育、成苗和鳞茎膨大等。具体要求如下：
①营养要求：
无机营养：氮、磷、钾、硫、钙、镁等大量元素和铁、锰、铜、锌、硼、钴、钼等微量元素是大蒜生长发良必需的营养元素。在培养基中的活性成分为离子形式，一种类型的离子可由一种以上的盐提供。
有机营养：包括氮源和碳源。为了能使组织生长良好，在培养基中常需补加一种或数种维生素和氨基酸，其中，维生素B1是必不可少的，维生素B3、维生素B6和肌醇都能改善大蒜培养组织的生长状况。
②基质：脱毒蒜组培多用琼脂培养基作为基质，一般使用浓度为0.5%～1.0%。
③激素：除了营养物质外，为了促进组织器官的生长，通常必须由外源补给一种或数种植物生长调节物质，对这些物质的要求因外植体组织、培养阶段和增减目的的不同而有很大的变化。
生长素：有组培中，生长素被用于诱导细胞的分裂和根的分化。常用的生长素有：NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、NOA（萘氧乙酸）、2，4-D（二氯苯氧乙酸）等。其中，NAA和IBA广泛用于生根，并能与细胞分裂素配合促进茎的增殖。2，4-D是诱导外植体愈伤组织不可缺少的，不同外植体对2，4-D浓度要求不同，茎尖需0.125毫克/升2，4-D的MS培养基，试管苗的茎需0.5毫克/升2，4-D的MS培养基。
细胞分裂素：主要具有促进细胞分裂和从愈伤组织或器官上分化不定芽，有助于使腋芽从顶端优势的抑制下解放出来，促进茎的增殖作用。常用的细胞分裂素有BAP（苄氨基嘌呤）或6-BA（6-苄基腺嘌呤）、ZT（玉米素）和KT（激动素）等，其中以6-BA最为常用。
赤霉素：具有促进大蒜茎尖发生多芽及稳定微管、拮抗鳞茎形成的作用。赤霉素有20多种，主要由根系供给，去除根系可促进叶鞘细胞的膨大，有利于鳞茎形成。在大蒜鳞茎形成过程中，赤霉素含量先下降，后上升，赤霉素含量降低对鳞茎形成有利。长日照诱导大蒜植株体内赤霉素含量降低是事实，故长日照对鳞茎形成的促进作用是通过影响内源赤霉素水平实现的。
乙烯：乙烯通过改变细胞壁形状和纤维素微纤丝的排列方向来刺激叶鞘细胞的侧向膨大，而不是纵向拉长。另外，乙烯可诱导叶片衰老，通过抑制叶片生长，使叶身和叶鞘长度相对比例发生改变，从而有利于鳞茎形成。
④酸碱度要求：在灭菌前，培养基的酸碱度一般调至pH5～6。当pH＜5时，培养基（琼脂）不能凝固；pH＞6时，培养基将会变硬。但熊正琴（1999）观察到，大蒜幼芽在pH＝6.4时生长最佳，增殖最快。刘高琼（1995）认为，徐州白蒜和太仓白蒜组培幼芽分化数、发根数和幼芽生长的最佳培养基酸碱度为pH＝7.5（微碱性）。
⑤温度和光照要求：
温度：在大蒜试管苗培育中，温度一般为15～20℃，较低的温度及较大的温差有利于培育壮苗；试管蒜苗必须经过一段低温（＜20℃）春化阶段后，进入较高温度和较长、较强的光照条件后才能诱导试管鳞茎的形成与膨大，大蒜试管鳞茎形成与膨大的适温是20～25℃。
光照：对光照的要求实质上是对光周期、光强、光质的要求。
光周期：试管苗培育的光周期以12小时为宜。光周期长短对鳞茎形成至关重要，较长的日照条件有利于鳞茎膨大。但鳞茎形成对光周期反应的要求因大蒜品种生态型而异，如低温反应迟钝型蒜种，在12小时日照下，一般不形成鳞茎，日照长达16小时虽能形成鳞茎，但发育不良；而低温反应敏感型蒜种，在12小时日照下鳞茎发育良好。
光强：在一定的光周期下，强光照比弱光照条件下易于形成鳞茎。光照强，合成的碳水化合物就增多，其积累的多少是鳞茎膨大的物质基础。但对鳞茎形成的诱导，即使弱光照，只要光照时数超过临界周期，均可开始形成鳞茎。
光质：对大蒜使用白炽灯补光，对试管鳞茎形成与膨大具有明显的促进作用。植物光敏素的光平衡态Φ值与光质关系很大，通常用R∶FR（红光：远红光）光量子比率来衡量，随着R∶FR值降低，鳞茎膨大速度加快，光质在鳞茎形成中起着重要的调节作用，且这种调节作用与其内源乙烯生成可能有关。
（2）脱毒大蒜组培培养基的制备
①配制浓缩储备液：大量元素浓缩20倍、微量元素浓缩200倍，铁盐浓缩200倍，除蔗糖之外的有机物质浓缩200倍。在配制这4种储备液时，应使每种成分分别溶解，然后再把它们彼此混合。
各种激素的储备液应当分别配制，如果不溶于水，则应先溶解在少量的适当溶剂中，然后再加蒸馏水到最终容积。根据所要求的激素浓度水平，其储备液的浓度可以为0.001～0.01微摩尔/升。生长素一般溶于95%酒精或0.01微摩尔/升的氢氧化钠中，后者的溶解效果更好。细胞分裂素一般溶于0.5～1微摩尔/升的盐酸或稀的氢氧化钠溶液中。赤霉素易溶于冷水，但GA3溶于水后不稳定，容易分解，最好用95%酒精配成母液。
所有的储备液应储存在适宜的塑料瓶或玻璃瓶中，放置冰箱中保存。铁盐储备液必须储存于棕色玻璃瓶中。在使用这些储备液之前，轻轻晃动瓶子，如果发现其中有沉淀、悬浮物或微生物污染，则必须立即将其淘汰。在制备储备液和培养基时，应当使用蒸馏水或去离子水以及高纯度的化学试剂。
②制备培养基的步骤
a.称量规定数量的琼脂和蔗糖，加水到最终容积的2/3，加热使之溶解。因蔗糖易溶解，也可以在琼脂溶解之后加入。
b.分别加入一定量的各种储备液。如果由于特殊原因需要在高压灭菌之后再加入维生素和激素，则可在调节这些物质溶液的pH后，使之通过微孔滤器（孔径为0.22～0.45微米）消毒。
c.加蒸馏水至培养基的最终容积。
d.充分混合后，用0.1微摩尔/升。氢氧化钠和0.1微摩尔/升盐酸调节培养基的pH。
e.趁热将培养基（为均匀的液态）分装到所选用的培养容器中（约为容器容积的1/3）。
f.用包在纱布中的棉塞或铝箔、牛皮纸等其他适宜的塞或盖封严瓶口。
g.将其在121℃，1.15×105帕斯卡压力下灭菌15～20分钟。
h.使培养基在室温下冷却后低温下保存，所有培养容器都必须做好标记，使得在高压灭菌和贮藏后也能清楚地识别。
（3）脱毒大蒜微繁的操作技术
①脱毒大蒜组培的技术体系可以是试管苗，也可以为试管鳞茎。从外植体可以直接诱导芽的再生、增殖，保持种性稳定，也可以先诱导形成愈伤组织，再增殖分化。因此，大蒜组织培养可分为四条途径：一是由外植体诱导再生试管苗；二是由外植体直接诱导形成试管苗；三是诱导愈伤组织再生植株后在试管内形成小鳞茎；四是由直接萌芽形成的试管苗在试管内形成小鳞茎。
由于经愈伤组织途径容易发生变异，因此，在以保持品种优良特性为原则的脱毒扩繁过程中应慎用。
②脱毒大蒜组织无菌培养的一般步骤：
a.将大蒜瓣（或蒜薹切段）置于玻璃瓶中，在超净工作台上，先用75%酒精进行表面消毒5分钟（或40秒），再在含有几滴活化剂的种类及浓度适当的消毒液（如0.2%升汞液）中消毒20分钟或12分钟。在消毒期间需摇动玻璃瓶2～3次。
b.消毒处理后，将消毒液倒出，加入适量的无菌蒸馏水，摇动数次，将水倒掉，如此重复3～4次。
c.将材料取出，置于已经灭菌的培养皿中。
d.在对大蒜材料进行消毒处理的同时，对所要使用的器械进行消毒，方法是把它们浸入95%酒精中，取出后再置酒精灯火焰上灼烧，待冷却后即可使用。所有器械往往需要在每次使用后消毒1次。
e.使用这些消毒过的器械从已经过表面消毒的材料上切取适当的外植体——茎尖。
f.将培养容器的盖或塞打开，将外植体接种到培养基上。如果使用的是玻璃容器，把瓶口置酒精灯火焰上烘烤数秒，然后迅速用瓶盖或瓶塞封严。
g.培养基及器皿灭菌采用常规方法即高压灭菌法操作。
③脱毒大蒜试管微繁的操作技术：
a.从外植体直接诱导芽和根的形成。从外植体直接诱导产生不定芽和根，一般要经过起始培养、不定芽的诱导和生根培养等过程。各种外植体在MS、B5、LS培养基中均可再生为完整植株。
细胞分裂素的存在是芽形成的前提。较高浓度的BA促进芽形成，添加1～2毫克/升BA即可诱导芽的形成。无激素培养基利于生根，培养基中添加NAA促进生根，但添加BA会抑制生根。
外植体来源不同，对激素要求不同。从花薹再生芽只需0.1毫克/升NNA的MS培养基。从蒜瓣分化芽中，低浓度生长素（NAA）与高浓度细胞分裂素（KT）配合分化最好；幼芽的增殖要求生长素浓度高于细胞分裂素，添加0.1毫克/升玉米素（ZT）时促进带幼叶的茎盘中不定芽的分化而形成丛生芽。加入一定浓度GA3有利于茎尖诱芽。青霉素的存在有利于芽的形成，同时降低污染。
贮藏温度对产殖珠影响随外植体而异。蒜瓣5℃低温贮藏后促进芽和根的形成。而气生鳞茎60天5～7℃低温处理后只促进发芽率，并不影响芽数。取材部位不同，萌芽能力差异很大。只有带节处的花茎培养才能诱导萌芽，花茎其他切段无效。
b.试管苗的驯化、田间生长。试管苗一般需先用蛭石、岩棉、珍珠岩等做基质，营养液浇灌，进行驯化栽培。在移栽时接种Glomus mosseae可促进试管苗生根，提高成活率。具根小鳞茎的试管苗移栽成活率达92%，明显高于有根但无小鳞茎的试管苗（53%）。
④脱毒试管鳞茎微繁的操作技术：试管鳞茎的培育一般要经起始培养、芽的增殖、试管鳞茎形成3个阶段。在外植体启动，愈伤组织诱导，试管苗生根等大蒜离体培养中均有关于大蒜试管鳞茎形成的实例。用茎尖、茎盘、带幼叶的茎盘、双鳞片、花薹等外植体，在MS、或B5、或LS培养基上均能形成试管鳞茎。
低浓度激素（BA、NAA）促进鳞茎形成，甚至以无激素培养基为优。以茎尖为外植体时，低浓度的激素促进鳞茎的形成；茎盘为外植体时，2毫克/升BA促进鳞茎的形成，高浓度BA促进芽形成。NAA有利于小鳞茎根的形成，培养基中1.0毫克/升NAA使80%小鳞茎生根。鳞茎在2毫克/升NAA+BA0.05毫克/升的MS培养基上有利形成，无激素上膨大。
较高浓度（90～120克/升）的蔗糖有利于鳞茎形成。在培养基中添加（5克/升）活性炭能促进鳞茎的形成。长光照、远红光促进鳞茎形成与膨大。
不同生态型品种在同一离体条件下形成鳞茎的数量、质量有差异。离体条件下，试管鳞茎的形成对光周期的要求在春、秋品种间差异显著，3～4℃低温预处理促进鳞茎形成，春蒜品种必需经过低温预处理才能形成鳞茎。
环境条件对鳞茎形成的诱导作用不能用改变培养基成分来替代。试管鳞茎不需驯化，直接移栽。试管鳞茎大小与田间发芽率、株高、产量呈正相关。试管鳞茎大小及种植密度影响鳞茎的产量及质量。形成的试管鳞茎（晚熟种）经35～20～5℃后可打破休眠。
熊正琴等（1999）用生长整齐一致的徐州白蒜脱毒试管苗为外植体，经起始培养基、继代增殖培养基、鳞茎诱导培养基的连续培养后，可使鳞茎诱导率达90%，鳞茎鲜重达300毫克以上，鳞茎直径达15毫米。
⑤提高微繁系数：
a.选择适宜的外植体。芽是脱毒蒜速繁的基础，诱导外植体直接产生脱毒多芽，可大大提高快繁基数。
大蒜品种间茎尖发生芽数差异明显。休眠鳞茎茎尖发芽数显著少于已经打破休眠的鳞茎。通过低温处理种蒜可明显增加茎尖发芽数，剥离茎尖大小也影响所发生的芽数，带2～3个叶原基的大茎尖比带1个叶原基的小茎尖发生的芽数多，但大茎尖所得苗的脱毒率低于小茎尖。将鳞茎置于37℃热处理20～30天，大茎尖苗脱毒率与小茎尖相似。因此，先将鳞茎热处理，再剥离大茎尖培养，即可获得脱毒率高的多芽。
蒜薹可以产生多气生鳞茎，表明具有很强的腋芽萌发潜力；同时作为生殖器官和分生组织，生殖茎尖具有更多的腋芽原基和更强的脱毒潜力。大蒜不同品种间生殖茎尖发生芽数差异明显，芽多者往往生长较弱，必须切割分离多芽进行壮苗培养。
b.提高代增殖系数。适时切割起始培养基中形成的多芽进行继代增殖，是提高代增殖系数关键环节。培养基中的激素种类、浓度及比例以及愈伤组织的诱导、分化及鳞茎形成等都会影响代增殖系数。
愈伤组织的诱导：培养基MS、B5、改良B5（BDS）、LS、N6中均可诱导愈伤组织产生。外植体不同，对激素要求有差异。茎尖和叶片在含1～2毫克/升IAA或0.05～1.0毫克/升2，4-D的培养基上具有很好的出愈率。2，4-D和KT对诱导花梗形成愈伤组织是必要的。添加2，4-D后，花薹就会形成愈伤组织。花药培养在2毫克/升NAA的B5培养基中，诱导愈伤组织效果好。分生状根瘤（MRTs）的形成需较低浓度（0.5毫克/升）NAA及无KT，根瘤的形成与正常生根能力呈负相关。蒜瓣低温贮藏促进愈伤组织形成，但无2，4-D时，蒜瓣低温预处理并不促进愈伤组织的形成。花药5℃低温预处理1～2天有利于愈伤组织的诱导。
愈伤组织的增殖：愈伤组织的生长一般不要求光照，温度以25℃较宜。定轨摇床培养时，70转/分种时利于愈伤组织生长，150转/分钟时促进球状体的形成，继而可再生成苗。茎尖愈伤组织在含较高浓度BA、NAAR的MS培养基中增殖生长最快。2毫克/升IAA促进愈伤组织的生长，而IBA、BA无此作用。
愈伤组织的分化：愈伤组织的分化通常要求光照。不同来源的愈伤组织分化能力不同。从叶原基来的愈伤组织比从茎尖诱导的更易分化；从花药来的外植体最有利于芽的形成、增殖和生根，不正常的根容易分化不定芽，在0.5毫克/升IAA+5毫克/升BA中最佳。分生状根瘤（MRTs）可作为一种好的外植体，因其形成的愈伤组织具有很好的器官形成能力。小根和花梗上部比大根、花梗基部来的愈伤组织易于芽和根的再生。
芽、根的分化条件有异：高浓度NH4+利于芽分化。BA对幼苗的分化是不可缺少的。无2，4-D时利于再生。王洪隆报道，高浓度细胞分裂素和低浓度的生长素利于芽的分化，在无激素的MS培养基中可生根。低浓度的BA、NAA利于植株再生。
不同来源愈伤组织的分化对激素要求有异。从花薹来的愈伤组织在2，4-D存在时即可分化芽和根。试管苗根尖形成的根瘤分生组织可在0.5毫克/升NAA或0.5～1.0毫克/升NAA+1.0毫克/升KT的MS培养基中再生为完整植株。愈伤组织的分化随培养基的不同，对激素要求也不同。不定芽的发生在B5培养基中需要高浓度的KT（2～4毫克/升），在LS培养基中需要低浓度的BA（0.25毫克/升）。花药愈伤组织在B5培养基上分化效果比在LS培养基上好。花梗愈伤组织经低温处理对芽分化是必要的。从愈伤组织分化出来的当代植株，由于根主要是从愈伤组织块上长出来，而不是从幼苗基部长出，最终造成根、芽脱离，移栽成活率只有10%～20%，有效的解决方法是从幼苗直接诱导出鳞茎。
愈伤组织的变异：愈伤组织形成过程中的染色体变异可能与生长调节剂种类、浓度有关。Dolezel等用BDS培养基研究表明，5～50微摩尔/升NAA增加有丝分裂异常的细胞数目，但当总的激素浓度达500微摩尔/升时显著抑制有丝分裂活性，使有丝分裂异常，所以较低浓度的激素可使细胞有丝分裂正常化。
随继代时间延长，变异加重。愈伤组织继代4个月后，二倍体从开始的52%下降至16%，且再生频率降低。继代时间一年后，芽的分化率从60%降至10%。1～3戈瑞辐照叶片后可促进愈伤组织生长，且不影响苗的再生，可用于突变体筛选。
综上所述，使试管苗健壮生长、提高试管鳞茎诱导率并促进其膨大的所有因素，都将影响脱毒大蒜微繁系数的提高。
⑥注意事项：
a.病毒检测。尽管在切取茎尖时十分小心，并且对其进行了各种有利于消除病毒的处理，也只有一部分培养物能够产生无病毒植株。因此，对于每一个由茎尖产生的植株，在用做母株以生产无病毒原种之前，必须针对特定的病毒进行检验。培养植物中，很多病毒具有一个延迟的复苏期。因此在头18个月内必须对植株进行若干次检验。只有那些的确已经脱除了某种病毒，才可以在生产上推广使用。由于经病毒检验的植株仍有可能重新感染，因而在繁殖过程和各个阶段还需进行重复检验。必须在能杜绝任何侵染可能性的条件下繁殖这些确已脱毒的植株。
b.优选株系。将培养后代按生长势分类，每次选用生长一致的植株进行继代培养，个体间就会生长充分，不受抑制。
c.适时诱导鳞茎形成。试管鳞茎的培育一般要经起始培养、芽的增殖、试管鳞茎形成3个阶段。但芽的增殖阶段不能无限地进行下去，必须适时诱导鳞茎形成。试管鳞茎形成需要一定的幼苗生长为前提，同时应尽可能在温度较高的夏秋季节诱导鳞茎形成，以降低生产成本，并能与大田生长季节相衔接。
d.适时更新换代，防止玻璃化。当一种无菌培养方法建立后，很容易连续繁殖下去，而不与原亲本植株进行比较，就可能使培养早期发生的变异积累起来。同时，根据研究经验，若不断重复进行离体繁殖，部分培养物的叶片常常变成渍水状，几乎是半透明的，此类试管苗的生长和繁殖速度将会下降，最后甚至死亡，这就是玻璃化现象，很难彻底消除。因此，应当注意适时更新换代，防止玻璃化。
