融化培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基放入水浴中加热至融化。
倒平板：待培养基冷却至50℃左右，按无菌操作法倒2只平板(每皿约15ml)，平置，待凝固。
作分区标记在皿底将整个平板划分成A、B、C、D四个面积不等的区域。各区之间的交角应为120℃左右（平板转动一定角度约60℃），以便充分利用整个平板的面积，而且采用这种分区法可使D区与A区划出的线条相平行，并可避免此两区线条相接触。
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划线操作：
(1)挑取他含菌样品：选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量菌种。
(2)划A区：将平板倒置于煤气（酒精）灯旁,左手拿出皿底并尽量使平板垂直于桌面，有培养基一面向着煤气灯(这时皿盖朝上，仍留在煤气灯旁)，右手拿接种环先在A区划3—4条连续的平行线(线条多少应依挑菌量的多少面定)。划完A区后应立即烧掉环上的残菌，以免因菌过多而影响后面各区的分离效果。在烧接种环时，左手持皿底并将其覆盖在皿盖上方(不要放入皿盖内)，以防止杂菌的污染。
(3)划其他区：将烧去残菌后的接种环在平板培养基边缘冷却一下，并使B区转到上方，接种环通过A区(菌源区)将菌带到B区，随即划数条致密的平行线。再从B区作C区的划线。最后经C区作D区的划线，D区的线条应与A区平行，但划D区时切勿重新接触A、B区，以免极该两区中浓密的菌液带到D区，影响单菌落的形成。随即将皿底放入皿盖中。烧去接种环上的残菌。
恒温培养：将划线平板倒置，于37℃（或28℃）培养，24hr后观察。
