1涂片：左手持菌液试管右手持接种环用接种环试管培养液取环菌酒精灯外焰穿于载玻片央涂薄层（事先背面做标记圆圈）即或先滴滴菌水于载玻片央用接种环斜面挑少许与载玻片水滴混合均匀涂薄层
拔或塞试管塞应试管口通火焰略加烧灼接种环火焰烧灼灭菌
2干燥：涂片室温自干燥酒精灯略加温使迅速干燥勿靠近火焰
3固定：用高温进行固定即手持载玻片端标本面朝灯火焰外侧快速移3~4共约3~4秒要求玻片温度超60℃玻片背面触及手背皮肤觉烫宜放置待冷染色
4.染色：
（1）初染：加草酸铵结晶紫滴约钟水洗
（2）媒染：滴加碘液冲残水并覆盖约钟水洗
（3）脱色：载玻片水甩净并衬白背景用95%酒精滴洗至流酒精刚刚现紫色止约20—30秒立即用水冲净酒精
（4）复染：用番红液染1—2钟水洗
5.镜检：干燥置油镜观察革兰氏阴性菌呈红色革兰氏阳性菌呈紫色散细菌革兰氏染色反应准于密集细菌呈假阳性
6.同载玻片肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片作革兰氏染色比
革兰氏染色关键于严格掌握酒精脱色程度脱色度则阳性菌误染阴性菌；脱色够阴性菌误染阳性菌外菌龄影响染色结阳性菌培养间或已死亡及部菌自行溶解都呈阴性反应
