1.以TE缓冲液悬浮λ多联体(Boehringer MA宝灵曼公司产品),浓度为4μg/40μl。
2.用等体积TE配制的2%低熔点琼脂糖(温度保持在45℃)混匀。
3.移去混合液注入预冷的凝胶块模具中。
4.室温下用TE及100 mmol/L NaCl溶液温育2天。 1.从YPD(酵母提取物,蛋白胨和葡萄糖)培养基瓶皿中挑选单一克隆加入10ml
YPD预培养的肉汤中,30℃下剧烈震荡生长24小时,然后加入200ml YPD肉汤,剧烈振荡24~48h(产量大约100块)。
2.4000×g转速,离心10min,然后用50mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液悬浮。
3.仍以4000×g转速离心10min,再用SCE[1 mol/L 山梨醇,0.1mol/L枸椽酸钠,pH5.8及10 mmol/L
EDTA (pH7.5)]溶液重悬。
4.取稀释后的细胞悬液用Neubauer腔计数。
5.溶液短暂离心后,再用SCE重悬细胞,使40μl SCE溶液中含5×107个细胞(相当于80μl体积的模块中含有5×107个细胞)。
6.溶液与0.1mg/ml酵母扣糖酶100T和100mmol/Lβ-巯基乙醇混匀,37℃保温15~30min。
7.细胞悬液与等体积的SCE配制的2%低熔点琼脂糖凝胶混匀,保持在50℃。
8.将混合物移注入预冷的凝胶块模具中。
9.凝胶块用含10 mmol/L二硫苏糖醇的SCE溶液37℃下振荡温育1~2小时。
10. 将凝胶块移入蛋白酶缓冲液中,加入2mg/ml蛋白酶K,50℃温育48h。
11. 用50 mmol/L EDTA/10 mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液洗涤凝胶块3次,每次20min。
12. 凝胶块可用此混合液于4℃保存或不用漂洗直接装载入凝胶中。