抗体基因的突变导人可以是随机的，也可以在特异性位点上。随机导人突变最为简单，而且也不需要推测哪个位点是提高亲和力的最佳突变位点。随机突变更接近体内的体细胞高突变过程。导人随机突变的一种常用方法是链改组。这种方法是两条链(VH和VL)中的一条被先固定并与另外一条链的基因文库结合产生1个次级文库，再从中寻找更佳配对。另外一些随机突变方法包括易错PCR、DNA改组或在大肠杆菌(Escherichia coli)突变株中繁殖噬菌体。对于半抗原，这些方法可以使亲和力大幅增加(可达300倍)；但对于蛋白质抗原，仅会有一个温和的提高(小于10倍)。随机突变的一个限制是：有关调节亲和力的突变定位方面有价值的信息相当匮乏。在高亲和力结合性抗体的序列中会显示多个突变位点，但不能确定哪些能提高亲和力而哪些没有作用甚至实际上起到负面作用。如果抗体亲和力提高不能达到预期效果，那么这些有关突变的信息就可以用来对续后的突变进行指导。此外，由于随机突变被导人到框架区，那么当抗体用于治疗时，这种方法就可能产生免疫原性的问题。再用DNA改组去除有害或不必要的突变，会最大程度地减小此问题的影响。
另外，也可以用合成的寡核苷酸在抗体基因特异性区域导人突变。需要确定的是：哪些残基需要突变。这是因为仅仅5个氨基酸的随机化就需要3．4×107个克隆，才能完全覆盖序列空间。有几个研究小组显示将突变定位于互补决定区域(CDR)是提高抗体亲和力的有效手段。这个方法的作用在于在体内体细胞高突变时，与框架区残基相比，突变更优先集中于CDR。这些CDR突变的定位可以与原始抗体文库中多样性产生的位置互补。不过需要注意的是，有许多CDR残基，尤其是位于VHCDR3和VLCDR3区域的残基，关乎抗原抗体之间的高能作用。因此，许多情况下，此区域突变可消除其结合抗原的能力。为了更有效利用序列空间，我们更倾向于采用对野生型残基有偏好的核苷酸混合物，从而使无用结构的数目降至最低。CDR区突变可以通过引入新的接触点，或用更适宜接触点取代那些低亲和力或“排斥性”接触点。然而，似乎无论体内体细胞高突变还是体外随机突变导人的多个突变，对亲和力所施加的影响都是间接性的。它们通过对CDR或者接触点残基的侧链进行重新定位，来优化与抗原间的相互作用。
抗体可以含有超过50个CDR残基。因此带来一个问题，就是选择哪个CDR区和哪个CDR残基进行突变。我们和其他小组的结果都显示：定位于VH CDR3和VL CDR3的靶向突变是用噬菌体展示提高亲和力的最有效方法。例如，我们通过依序靶向突变VH和VL CDR3区域，可以将一种抗ErbB2抗体的亲和力提高1200倍以上。与之类似，Yang等人突变了5个基因文库中的4种CDR(VH CDRl、VL CDRl、VH CDR3和Vu CDR3)将突变相互独立组合，可以使抗gpl20 Fab的亲和力提高420倍。不过，他们也观察到，优化CDR3区可以使亲和力提升的幅度达到最大。因此，我们开始时也是选择VH和VL CDR3区域进行突变。
当进行CDR残基随机化时，最能有效利用序列空间的手段是将蛋白数据文库(PDB)中同源性最高的V区结构域进行分子建模；这样可以分辨出哪些是含有溶剂可接近性侧链的残基，而哪些是含有隐蔽性侧链的残基。我们前期的试验结果表明：对含有隐蔽性残基的随机化通常只会导致重新选择野生型序列。我们也避免对甘氨酸和色氨酸进行突变，因为二者在选择后会毫无例外地恢复为野生型。甘氨酸常常是CDR转角的关键性残基；色氨酸则通常是基本结构的或接触点残基。另外一些选择适当CDR残基进行突变的方法是基于对体内亲和力成熟中突变位点的研究基础之上。再次免疫反应时，突变会频繁集中于CDR中的一些热点。例如，体内中AGY所编码的丝氨酸比TCN更易突变D6]。我们用位点导向突变方法进行亲和力成熟时，也观察到类似的突变模式并建议可以针对这些热点残基进行靶向突变。有篇进行亲和力成熟的报道，其中仅仅对VL CDR3中类似热点进行了靶向定位突变，却成功提高了来自很小容量抗体文库中抗体片段的亲和力。
CDR的优化可采取平行或序贯方法进行。在CDR3平行随机化时，将两个CDR3分别独立随机化，再将单独克隆中有利的突变合并在一起。虽然这个策略在数种抗体优化中获得成功，但并非所有突变都能累加。这不难理解，因为许多CDR残基是互不兼容的。因此，我们倾向于对抗体CDR区进行序贯靶向突变。
在我们实验室，提高抗体亲和力的靶向位点突变和链改组(随机突变)两种方法都被采用。我们还用抗ErbB2单链Fv(VH和VL)抗体片段(scFv)对这两种方法进行了比较。总体上，发现抗体中CDR3的靶向位点突变是利用噬菌体展示提高亲和力更为有效的方法。我们实验室从事scFv抗体片段研究方面的工作，因此以下实验方案都以此模式为基础，尽管总体原则上这些实验方案也可被用于抗原结合性抗体片段(Fab)的成熟。
