细胞因子检测方法哪位了解，好一些的生物学科网有哪些

目前，细胞因子已广泛应用于临床的已有EPO、IFN-α、G-CSF、GM-CSF以及试用于临床的白细胞介素等。为了研究细胞因子在生理系统的作用以及了解细胞因子产品用于临床治疗的效果，进行细胞因子的检测就必不可少，而且用于临床诊断的细胞因子分析方法必须适用于常规操作。细胞因子的检测尚未在临床诊断上广泛开展，已知目前采用的细胞因子检测方法均不完善，且不同的检测方法所得的结果差异较大，给临床治疗带来一定的困难。因此，有必要了解各种检测方法的特性及影响细胞因子浓度的因素。1原理和方法细胞因子的发现依赖于其生物学活性，因此，建立了生物分析法用于细胞因子的检测。随后，用于检测实验溶液(如组织培养上清液)中细胞因子的免疫分析法被建立，并不断用于实验室研究。但准确地、可重复地测定细胞因子具有一定困难，主要原因是众所周知的细胞因子的含量极低(大部分都是以pmol/L计)，同时存在着源于异嗜性抗体，类风湿因子以及特异的和非特异的细胞因子结合蛋白等的显著干扰。在生物帮那里可以详细的了解一下，那里有很多实验领域的精品技术文件，并且图文并茂，提供生物领域的学科知识、实验技术方法与技巧等pleaseclicktoconnectwww.bio1000.com/zt/cell/46213.html.thatcanhelpyou细胞因子生物学活性检测和浓度测定的分析方法主要有以下几类。1.1生物分析法生物分析法方便，敏感性高，但所有细胞系有可能受几种细胞因子的影响，特异性则较差。又由于可溶性细胞因子受体等抑制剂的存在，使生物分析法可能低估细胞因子的活性。常用的方法有2种:(1)依赖性细胞株增敏实验。一些肿瘤细胞株依赖于细胞因子方能在体外增殖，如TF-1细胞株依赖于GM-CSF和IL-3，CTLL细胞株依赖于IL-2，TTD-1细胞株依赖于IL-6等。可利用这些依赖株检测相应的细胞因子。但是，并非所有细胞因子均有相应的依赖株，因此限制了此法的应用。(2)功能检测实验。利用一些细胞因子的功能特性而建立相应的活性测定方法。如IFN抗病毒实验和TNF对L929细胞的杀伤作用等。此外，生物分析法还有骨髓集落形成实验，细胞毒或细胞抑制实验，次级分子分泌的诱导，化学趋化和细胞因子分泌性的抑制实验等。1.2免疫分析法利用抗原机体反应的原理，制备出抗细胞因子的单抗或多抗，可进行细胞因子的免疫检测，它包括放免实验(RIA)和酶联免疫吸附实验(ELISA)等。其优点是高特异性、高灵敏度、操作简便。缺点是不能证明被测细胞因子是否为具有完整生物活性结构的蛋白质而非变性蛋白质。1.3CKmRNA的测定(1)分子杂交实验:首先制备出细胞因子的基因探针，通过分子杂交检测细胞内CKmRNA的表达。(2)逆转录PCR(RT-PCR)法技术:可快速、灵敏地检测表达很低的CKmRNA，并可同时测定同一样本中多种CKmRNA，操作过程包括细胞因子产生细胞的RNA提取，mRNA经逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，在细胞因子引物的引导下，即可进行PCR扩增。根据定量CKmRNA方法和原理的不同，可分为半定量PCR法，竞争性定量PCR法，内参标定量PCR法，HPLC-PCR法和酶联免疫定量PCR法。目前市售的商品试剂盒已能用于大多数细胞因子的检测，但因其价格昂贵而阻碍了其广泛使用。同时，人细胞因子的测定仍存在许多问题，检测方法选择不当可能得到不一致的结果，有时有必要选择一个以上的检测方法测定细胞因子。2灵敏度细胞因子具有很强的生物学活性，其生物分析法的灵敏度极高。然而，在测定血浆中细胞因子正常浓度时，难以确定免疫分析法令人满意的灵敏度。不同细胞因子的参考值变化很大，难以定义其参考值范围。如Damas等[7]在研究细胞因子与败血症时，使用两步免疫放射测定实验(IRˉMA)测定IL-6(灵敏度:5ng/ml)一步IRMA法测定TNF-α(灵敏度:5ng/L)和IL-1β(灵敏度:4ng/L)，在正常血清中未测得上述细胞因子。而Riikonen等使用具有相似检测限的RIA法，在20例健康儿童中，IL-1β的平均浓度为12.1ng/L，IL-6的平均浓度为83ng/L;在71例健康儿童中，TNF-α的平均浓度为40±2ng/L。由此可见，不同的免疫分析方法之间存在极大的差异，其灵敏度变化可能是由于其准确度和特异性的不同而引起。3准确度和特异性影响细胞因子检测准确度和特异性的因素有:(1)抗体:单抗的表位识别;(2)细胞因子:多种分子形式，结合蛋白复合物、抑制剂和可溶性受体复合物;(3)血浆基质:干扰抗体，异嗜性抗体和类风湿因子;(4)标准:重组参考物质可能不显示与样品平行的剂量———反应曲线。3.1细胞因子结合蛋白已知IL-1β、TNF-α和IL-6能结合从细胞进入血浆的可溶性受体或特异的拮抗剂。免疫分析法是否能识别这样的结合形式几乎是未知的，但是对TNF的研究得出了一些重要结论。20世纪80年代后期，《Lancet》上发表了大量关于癌症病人TNF-α测定缺乏可靠性和生物分析法与免疫分析法关系的文章。但使用竞争性免疫分析法时，癌症病人与败血症病人的TNF-α是可被检测的。而ELISA法由于不能测定TNF-α与P55TNF受体的结合物而无法测定癌症病人血浆中的TNF-α。3.2血浆中包含几种形式的IL-6分子，它们与一些抗血清的作用较弱，缺乏生物学活性并与其它血浆蛋白质以及IL-6的可溶性受体组成复合物。已知IL-6免疫分析法和生物分析测定其在正常血清中的浓度为0或在10～75ng/L范围，败血症病人的IL-6浓度升高到1～2μg/L，脑膜炎病人的IL-6浓度升到200μg/L。然而，May等说明大多数的检测方法仅仅测定了低分子量的IL-6，他们采用能识别IL-6高分子量的单抗，测得在正常血清中IL-6的浓度为1～10μg/L，并且在1例骨髓移植后病人的血清样品中，测得IL-6的浓度为5～10mg/L。3.3多种分子的形式一些细胞因子的多种分子形式已被充分认识，但是其对细胞因子测定影响的重要性并未得到彻底的研究。IL-6是一个最好的例子，它由一个位于第7染色体上，包含5个外显子的单一多杰基因编码。其氨基酸序列包括几个潜在的O-糖基位点，2个N-糖基位点和几个丝氨酸磷酸化位点。由细菌产生的重组IL-6的相对分子量为21Kd。人成纤维细胞至少分泌6种形式，相对分子量为23～30Kd的IL-6，它们均是糖蛋白，能在败血症病人的血浆中被检测。人内皮细胞分泌一种分子量为45Kd的IL-6，它似乎是血浆中的IL-6的主要存在形式。3.4人血浆中的干扰物质血浆中通常包含有与IgG反应的抗体。这些异嗜性的抗体可影响夹心免疫分析法，它们在俘获抗体和被标记的抗体间形成桥梁，而错误地导致高分析值。研究表明，15%～40%的病人样本中含有能够干扰检测的抗体。异嗜性抗体能与鼠、兔和牛血清免疫球蛋白发生反应，在大多数情况下，它们与牛IgG的结合最强。在检测中，加入正常的非免疫动物血清吸附异嗜性抗体，常能够消除这种形式的干扰。3.5类风湿因子是IgM的自身抗体Hamilton等的研究说明，IgM类风湿因子与鼠IgG的结合发生于1%的健康献血者和31%的类风湿关节炎病人。然而，也有研究表明，在9.1%的正常献血者中发生了这类结合。这些抗体可造成与异嗜性抗体完全相同的影响，并且他们在对细胞因子检测具有特别意义的类风湿病患者中的浓度极高。