1543年，也即哥白尼的革命著作问世那年，维萨留斯发表了他的伟大著作《伦人体构造》（De humani corporis fabrica）。论述骨骼、肌肉、血管、神经，腹部、胸部内脏、脑，对盖伦的“三位一体”学说提出挑战。书中论述了男女肋骨数相同，从而否定了女人是由男人的一根肋骨演变的说法；人腿骨是弯的，非直的；亚里士多德认为心管思维，维萨留斯认为脑管思维。
维萨留斯也是生理学家和美术大师，所以书中的插图大部由作者亲自绘制。图中表现出生活中的各种姿势，有的仰首，有的沉思，有的取自绞刑台下，还带着绳索，形象生动，栩栩如生，甚至连最枯燥的骨架，看上去也充满了生机。被称为“活的解剖学”。
他详细地记叙了关于人体骨骼、肌肉、血液以及各种器官的解剖结果, 并附有 300 多张精巧的解剖图。他批判了盖仑所说的血液可以通过人的心脏中隔从右心室渗入左心室的错误结论。通过解剖实践证明, 人的心脏中隔很厚, 并由肌肉组成, 血液是不可能通过中隔从右心室流到左心室的。尽管他在当时还不能指明血液是怎样从右心室流到左心室的, 但他却开辟了通过解剖研究血液循环理论的道路, 并对盖仑医学的错误予以否定。正像托勒密地心说的错误被教会绝对化、宗教化一样, 教会也把盖仑学说的错误加以利用,为宗教目的服务。因此, 维萨留斯也遭到了教会的迫害。宗教裁判所以“巫师”、“盗尸”等罪名判处他死刑, 只因他是西班牙国王的御医而幸免, 但财产被全部没收。以后教会又逼迫他去耶路撒冷朝圣, 以“忏悔罪过”。在朝圣的归途中, 他困死在希腊的一个岛上。
