主要有以下几方面原因：
第一，日本军国主义残暴的战争和侵略本性、反人类的非人道的罪恶本性。日本军队作为一部开动起来的侵略战争的机器，任何一个日本士兵加入进去，都会随着这部侵略战争机器而运转。因此，侵华日军在中国犯下的战争罪行，是日军作为一个整体、作为一部侵略战争机器而犯下的。
第二，南京是当时中国的首都，是重要的政治、经济、文化中心。日军正是企图通过对中国首都人民大规模的屠杀，迫使中国人民停止抵抗。日本当局以为攻陷南京，中国便会丧失斗志。“占领南京，迫使中国屈服”，这便是松井石根进攻南京的目的。
第三，日本侵略军的预谋。松井石根的《攻克南京城纲要》中有这样一段话：“一、若南京守城司令或市政当局留守城中，则劝其开城以和平占领。尔后，各师分别由经过挑选的一个步兵大队（9日改为三个大队）为基干，率先进城，分区对城内进行扫荡。二、若敌之残兵仍凭借城墙负隅抵抗，则以战场之所有炮兵实施炮击，以夺占城墙。尔后，各师团以一个步兵联队为基干进城扫荡。”中国军队投降被扫荡，不投降更要被扫荡。由此可见，这场大屠杀是有预谋、有计划、有组织的。
第四，报复中国军队的抵抗行动。由于南京守军，以及在此以前华北、淞沪守军的英勇抵抗，使得侵华日军决心用最残忍的办法来发泄他们的兽性。在战场上，日军遭到中国军队强有力的抵抗，使其“三个月灭亡中国”的迷梦被击碎。松井石根在远东军事法庭接受审判时说：“自登陆上海以来，因苦战恶斗，付出巨大牺牲，激起我官兵强烈之敌忾心”。中国军人的英勇战斗，加剧了日军的报复心理，使他们在未来的暴行中表现得更加残忍、疯狂。
第五，南京保卫战后中国9万军人滞留南京。由于唐生智不成功的撤退，使约9万中国军人滞留南京，一部分被俘，一部分潜入民间。日军占领南京后，多数没来得及撤退的中国军人被俘，绝大部分均遭屠杀，成为30万遇难同胞的一个重要组成部分，增大了遇难者的数字和大屠杀的规模；同时，由于数万名军人潜入民间，也给日本侵略军的疯狂屠杀提供了借口，日本侵略军进入南京城后，正是打着搜寻“便衣兵”的旗号，大肆捕捉无辜市民，恣意杀害。
第六，日军的心态。日军在南京疯狂地进行大屠杀，而且手段及其残忍。其主要原因是：
（1）有些日本学者认为是“虐待转移”。战争以前，无论长官如何对待士兵，日本士兵都要默默地忍受；而战争发生后则是：无论日本士兵选择那一种暴虐行动，中国人也必须默默地忍受。
（2）“病态的民族蔑视”。如1938年，日本士兵东史郎在南京时的日记中吐露，“现在一头猪比一个（中国）人更值钱，因为猪肉能吃。”
（3）“迷信天皇与暴力”。如一名曾参与南京大屠杀的日本士兵永富白道说，他从小受的教育使他深信，日本天皇是世界的当然统治者；大和民族优于世界上其他任何种族；日本的使命就是要控制亚洲。
