EOS5DMarkIII搭载了新开发的61点高密度网状阵列自动对焦感应器，能够更加精确地捕捉被摄体。通过改良自动对焦感应器的像素构造，低亮度下的可对焦界限达到-2EV（比过去高1级），可强效应对夜间与昏暗场景下的拍摄。61个自动对焦点中有41点采用呈十字型配置的自动对焦感应器，而且61点全部采用双线错置方式。即使对于仅由水平线和垂直线构成的被摄体，对焦误差也很小，能够稳定地进行自动对焦拍摄。EOS5DMarkIII采用的人工智能伺服自动对焦III代的算法与具备高捕捉能力的EOS-1DX相同。因为对动态被摄体的预测精度和追踪能力大幅提高，运动被摄体的速度、方向急剧变化时或多个被摄体交错的场景下，也能够连续捕捉主被摄体，能够轻松完成具有动感的人像和体育摄影。
为了能针对不同场景完成适合的拍摄，EOS5DMarkIII搭载了多样化的自动对焦区域选择模式，各模式下的61个自动对焦点或单点或多点联动，准确地捕捉被摄体。自动对焦区域选择模式包括61点自动对焦、单点自动对焦、定点自动对焦、扩展自动对焦区域（上下左右4点）、扩展自动对焦区域（周围）、区域自动对焦6种。扩展自动对焦区域模式有两种，可以根据被摄体的动作和性质选择。
扩展自动对焦区域：上下左右4点
单点自动对焦是从61个自动对焦点中任选1点进行自动对焦，能够切实捕捉被摄体。定点自动对焦比起单点自动对焦，能在更狭小的范围内对想要合焦的位置进行精密对焦。在进行人像摄影时想要对眼睛的瞳孔部分进行对焦，或是想要对复杂图形连续出现的被摄体的细微部分进行对焦等场合十分有效。61点自动对焦一般会对距离最近的被摄体进行对焦，拍摄无规律运动的被摄体，或在重视快门时机的抓拍中使用都很方便。
扩展自动对焦区域：周围
使用任意选择的1个自动对焦点及其上、下和两侧的4点或周围8点作为辅助自动对焦点进行对焦。适合在拍摄单点自动对焦难以追踪的动态被摄体时使用，可以兼顾对焦精度与快门时机。即使被摄体脱离所选的中心对焦点也能够通过联动的4个或8个自动对焦点进行对焦，辅助对焦点的数量随着被作为中心对焦点在画面中的位置而变化。适合用于动态人像摄影和规律运动较多的体育摄影。
区域自动对焦
61个自动对焦点分为9个区域，使用区域内的1个或多个自动对焦点进行对焦。拍摄激烈运动的被摄体时比扩展自动对焦区域的模式有效，适合想要优先考虑构图，同时又想高精度捕捉被摄体时使用。在所选区域内合焦于距离最近的被摄体，当被摄体覆盖多个自动对焦点时，可用多个对焦点捕捉被摄体，以防止中途脱焦。在体育摄影等要捕捉朝相机跑来的领先选手或拍摄激烈运动的单个被摄体时可以发挥威力。另外也适用于重视快门时机的抓拍。
