为什么一般情况下选择94℃30s可使各种复杂的dna分子完全变性
基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点.在标准反应中采用三温度点法,双链DNA在90～95℃变性,再迅速冷却至40 ～60℃,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至70～75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物链沿模板延伸.对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法, 除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用94℃变性,65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性).
1. 变性温度与时间：变性温度低,解链不完全是导致PCR失败的最主要原因.DNA在其链分解温度时的变性只需几秒钟,但反应管内达到Tss还需一定时间,变性温度太高会影响酶活性;通常情况下93℃～94℃1min足以使模板DNA变性,若低于93℃则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响.变性所需的加热温度取决于模板及PCR产物双链DNA中的G+C含量.双链DNA中的G+C的比率越高,则双链DNA分离变性的温度也就越高.变性所需的时间与DNA分子的长度相关,DNA分子越长,在特定的变性温度下使双链DNA分子完全分离所需的时间就越长.若变性温度太低或变性时间太短,则只能使DNA模板中富含AT的区域产生变性,当PCR循环中的反应温度降低时,部分变性的DNA模板又重新结合成双链DNA,从而导致PCR的失败.
