如何测定烈性噬菌体的一步生长曲线

2020-07-13 教育 471阅读
一步生长曲线
定量描述毒性噬菌体生长规律的实验曲线称为一步生长曲线。是研究病毒复制的一个实验,最初为研究噬菌体复制而建立,现已推广到动物病毒及植物病毒复制的研究中。具体操作是将适量病毒接种于高浓度敏感细胞培养物,或高倍稀释病毒细胞培养物,或以抗毒血清处理病毒细胞培养物以建立同步感染,以感染时间为横坐标,病毒的效价为纵坐标绘制出的病毒特征曲线,即为一步生长曲线。一步生长曲线分为潜伏期、裂解期和平稳期。
一步生长曲线不同阶段。
潜伏期:
指噬菌体的核酸侵入宿主细胞以后至第一个成熟噬菌体粒子
装配前的一段时间。它又可以分为两个阶段:
1、隐晦期:指在潜伏期前期认为的(用氯仿等)裂解宿主细胞以后,此裂解液仍无侵性的一段时间,这时细胞正处于复制噬菌体核酸和合成蛋白质衣壳的阶段;
2、胞内累积期:即潜伏期的后期,指在隐晦期后,若认为的裂解细胞,其裂解液已呈侵染性的一段时间,这意味着细胞内已经开始装配噬菌体粒子,此时电镜可以观察到。
裂解期:
紧接在潜伏期后的宿主细胞迅速裂解、溶液中噬菌体粒子急
速增加的一个阶段。噬菌体或者其它病毒粒因只有个体装配而不能存在个体生长,再加上若宿主细胞裂解的突发性,因此,从理论上来说,其裂解是瞬间出现的。但是事实上因为宿主群体中各个细胞的裂解不可能是同步的,故出现较长的裂解期。
平稳期:
指感染后的宿主细胞已经全部裂解,溶液中噬菌体的数目达
到最高峰,在这个时期,每一个宿主细胞释放的平均噬菌体粒子数即为裂
解量。
实验方法
一步生长曲线的实验方法如下:先把在对数期生长的敏感细菌悬浮液与适量的噬菌体混合,通常噬菌体和细菌的混合比例为1:10,避免几个噬菌体同时侵染一个细菌细胞。经数分钟吸附后,混合液中加入一定量的该噬菌体的抗血清,以中和尚未吸附的噬菌体。然后再用培养液进行高倍稀释,以免发生第二次吸附和感染。培养后定时取样,将含噬菌体的样品与敏感细菌混合,在平板上培养,计算噬菌斑数。结果可见,在吸附后的开始一段时间内(5~10min),噬菌斑数不见增加,说明噬菌体尚未完成复制和组装,这段时间称为噬菌体的潜伏期。紧接着在潜伏期后的一段时间(感染后20~30min),平板中的噬菌斑数突然直线上升,表示噬菌体已从寄主细胞中裂解释放出来,这段时间称为裂解期。每个被感染的细菌释放新的噬菌体的平均数称为裂解量。当宿主全部裂解,溶液中的噬菌体的效价达到最高点时称为平稳期。
结论
通过一步生长曲线可以得出病毒的潜伏期和裂解量。潜伏期是毒粒吸
附细胞受到感染细胞释放出子代毒粒所需的最短时间。裂解量是每个受染
细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目,其值等于稳定期受染细胞所释放
的全部子代病毒数目除以潜伏期受染细胞的数目,即等于稳定期病毒效价
与潜伏期病毒效价之比。single burst curve 定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线
。其基本步骤是用噬菌体的稀悬液感染高浓度的宿主细胞,以保证每个细胞
至多不超过一个噬菌体吸附。数分钟后中止吸附并稀释后置于该细菌最适生长温度下培养。在一定时间内,每隔数分钟取样作效价测定。以效价为纵坐标,培养时间为横坐标所绘成的曲线即为一步生长曲线,它可以反映每种噬菌体的三个最重要的特性参数:潜伏期、裂解期、裂解量。
双层平板法
又叫双层琼脂平板法
先在培养皿中倒入底层固体培养基,凝固后再倒入含有宿主细菌和一定
稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后,计算噬菌斑的数量。
方法:
双层琼脂平板法
1、 倒下层琼脂融化下层培养基,倒平板(约10mL/皿)待用。
2 、倒上层琼脂融化上层培养基,待融化的上层培养基冷却至50℃左右时,每管中加入敏感指示菌 (大肠杆菌) 菌液0.2mL,待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2~0.5mL,混合后立即倒入上层平板铺平。
3、 恒温培养
30℃恒温培养6~12h观察结果。
4 、观察结果
如有噬菌体,则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑——噬菌斑。
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