糖异生的途径基本上是糖酵解或糖有氧氧化的逆过程，糖酵解通路中大多数的酶促反应是可逆的，但是糖酵解途径中己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶三个限速酶催化的三个反应过程，都有相当大的能量变化，因为己糖激酶(包括葡萄糖激酶)和磷酸果糖激酶所催化的反应都要消耗ATP而释放能量，丙酮酸激酶催化的反应使磷酸烯醇式丙酮酸转移其能量及磷酸基生成ATP，这些反应的逆过程就需要吸收相等量的能量，因而构成“能障”，为越过障碍，实现糖异生，可以由另外不同的酶来催化逆行过程，而绕过各自能障，这种由不同的酶催化的单向反应，造成两个作用物互变的循环称为作用物循环或底物循环。
(一)由丙酮酸激酶催化的逆反应是由两步反应来完成的。
首先由丙酮酸羧化酶催化，将丙酮酸转变为草酰乙酸，然后再由磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶催化，由草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸。
这个过程中消耗两个高能键(一个来自ATP，另一个来自GTP)，而由磷酸烯醇式丙酮酸分解为丙酮酸只生成1个ATP。
由于丙酮酸羧化酶仅存在于线粒体内，胞液中的丙酮酸必须进入线粒体，才能羧化生成草酰乙酸，而磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶在线粒体和胞液中都存在，因此草酰乙酸可在线粒体中直接转变为磷酸烯醇式丙酮酸再进入胞液中，也可在胞液中被转变为磷酸烯醇式丙酮酸。但是，草酰乙酸不能通过线粒体膜，其进入胞液可通过两种方式将其转运：一种是经苹果酸脱氢酶作用，将其还原成苹果酸，然后通过线粒体膜进入胞液，再由胞液中NAD+-苹果酸脱氢酶将苹果酸脱氢氧化为草酰乙酸而进入糖异生反应途径，由此可见，以苹果酸代替草酰乙酸透过线粒体膜不仅解决了糖异生所需要的碳单位，同时又从线粒体内带出一对氢，以NADH+H+形成使1，3-二磷酸甘油酸生成3磷酸甘油醛，从而保证了糖异生顺利进行。另一种方式是经谷草转氨酶的作用，生成天门冬氨酸后再逸出线粒体，进入胞液中的天门冬氨酸再经胞液中谷草转氨酶催化而恢复生成草酰乙酰。有实验表明，以丙酮酸或能转变为丙酮酸的某些成糖氨基酸作为原料成糖时，以苹果酸通过线粒体方式进行糖异生，而乳糖进行糖异生反应时，它在胞液中变成丙酮酸时已脱氢生成NADH+H+，可供利用，故常在线粒体内生成草酰乙酸后，再变成天门冬氨酸而出线粒体内膜进入胞浆(图4-10)。
图4-10 草酸乙酸逸出线粒体方式
①苹果酸脱氢酶 ②谷草转氨酶 ③柠檬合成酶 ④丙酮酸羧化酶 ⑤ATP-柠檬裂酸酶合
(二)由己糖激酶和磷酸果糖激酶催化的两个反应的逆行过程
由两个特异的磷酸酶水解己糖磷酸酯键完成，催化G-6-P水解生成葡萄糖的酶为葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase)；催化1，6-二磷酸果糖水解生成F-6-P的酶是果糖二磷酸酶(fructose diphosphatase)。
除上述几步反应以外，糖异生反应就是糖酵解途径的逆反应过程。因此，糖异生可总结为：
2丙酮酸+4ATP+2GTP+2NADH+2H+ +6H2O→葡萄糖+2NAD++4ADP+2GDP+6Pi+6H+
图4-11 肝与肾皮质中糖氧化与糖异生的通路
现将肝脏和肾皮质中糖的氧化与糖异生作用过程总结如图4?1，糖异生作用的三种主要原料有乳酸、甘油和氨基酸等，乳酸在乳酸脱氢酶作用下转变为丙酮酸，经前述羧化支路成糖；甘油被磷酸化生成磷酸甘油后，氧化成磷酸二羟丙酮，再循糖酵解逆行过程合成糖；氨基酸则通过多种渠道成为糖酵解或糖有氧氧化过程中的中间产物，然后生成糖；三羧酸循环中的各种羧酸则可转变为草酰乙酸，然后生成糖。
